Caractérisation moléculaire de l’utérus carcinome à cellules claires pathologie moderne

Des études clinico soutiennent une classification de cancer de l’endomètre en deux types principaux, désignés comme type I et II, qui sont en corrélation avec leur comportement biologique. Plus récemment, des études moléculaires ont fourni de nouvelles informations sur ce système de classification par les événements génétiques élucidant impliqués dans le développement et la progression du cancer de l’endomètre. l’instabilité des microsatellites et des mutations dans le gène PTEN ont été largement associé au type I (endométrioïdes) carcinome de l’endomètre, alors que les mutations p53 ont été identifiées dans la majorité des cancers de l’endomètre de type II, dont le carcinome utérin séreuse est le prototype. Utérins carcinome à cellules claires (UCC) est une variante rare de cancer de l’endomètre et des études clinico ont donné des résultats contradictoires concernant son comportement biologique avec la survie à 5 ans allant de 21 à 75%. Les caractéristiques moléculaires du carcinome séreux endometrioid et ont été largement étudié; Cependant, il y a eu peu d’études génétiques moléculaires du sous-type de cellules claires. Dans cette étude, nous avons évalué 16 CCU (11 pur et 5 mixtes) pour des mutations dans le gène p53, un gène PTEN et d’instabilité microsatellite. Bien que nous avons constaté que ces altérations étaient rares dans les pures carcinomes à cellules claires, tous les trois ont été identifiés. En outre, deux cas de carcinome séreux et clair mixte ont montré une mutation identique du gène p53 dans les composants distincts histologiquement et un cas de carcinome et endometrioid clair mélangé avaient des mutations identiques dans les gènes PTEN et p53, et l’instabilité des microsatellites à la fois composants de métastases du carcinome des cellules rénales au poumon. Nos données suggèrent que UCC représentent un groupe hétérogène de tumeurs qui se posent par différentes voies pathogéniques petite espérance de vie du cancer du poumon à petites cellules. Des études moléculaires supplémentaires de carcinome à cellules claires pures sont nécessaires pour élucider les voies génétiques impliquées dans son développement et la progression.

Un total de 16 cas de carcinome à cellules claires de l’endomètre, y compris 11 UCC pur, deux cas de UCC mixte / UEC, deux cas de UCC mixte / USC et un cas de tumeur maligne mésodermique (MMMT) avec un composant de UCC, étaient choisis parmi les fichiers de pathologie chirurgicale du New York Presbyterian Medical Center Hospital-Cornell de 1979 à 1999. sur les 16 cas, 14 étaient des échantillons hystérectomie, dont neuf ont également inclus des échantillons de curetage de l’endomètre précédent. Deux cas (cas 1 et 3) étaient des spécimens curetage seul. Extraction de l’ADN

L’ADN a été extrait à partir de tissus normaux et tumoraux appariés inclus dans la paraffine en utilisant microdissection. Dans les cas mixtes, chaque composante histologiquement distincte a été séparément microdissection. Tous les cas ont été microdisséquées pour assurer plus de 85% des cellules tumorales. Analyse de la séquence des gènes PTEN et p53

Extrait d’ADN de la tumeur a été analysé pour des mutations dans le gène PTEN et gène p53 en utilisant la réaction en chaîne par polymérase spécifique de l’exon (PCR) et le séquençage d’ADN direct. Tous les cas ont été analysés pour des mutations dans les exons intragéniques 3, 4, 5, 7 et 8 du gène PTEN et dans les exons 5, 6, 7 et 8 du gène p53. Un volume de 3 à 6 ul de produit de PCR a été purifié par une méthode enzymatique, et soumis à une analyse de séquence d’ADN directe en utilisant le kit ThermoSequenase (Amersham Life Science, Cleveland, OH, USA) avec l’incorporation de didésoxynucléotides marqués par 33P. Les produits de PCR radiomarqués ont été fractionnés par électrophorèse sur un gel à 6% de Polyacrylamide dénaturant et visualisés par autoradiographie. Tous les cas avec des mutations ont été à nouveau amplifiés et re-séquencés pour assurer la reproductibilité. Analyse microsatellite Instabilité

l’instabilité microsatellite (MI) a été analysé dans les tissus normaux et tumoraux appariés en utilisant huit locus microsatellites sur quatre chromosomes différents petits de guérison du cancer du poumon à petites cellules. Sept locus anonymes dinucléotide microsatellites (D2S119, D2S123, D2S147, D10S197, D13S175, D18S58 et D18S69) et un locus mononucléotide microsatellites (Bat 26) ont été analysés. Radiomarqué [32P] Les produits de PCR ont été visualisés suivant un fractionnement électrophorétique sur 6% de polyacrylamide / 8 M d’urée gels par autoradiographie. Les tumeurs ont été déterminés comme étant MI-positif lorsqu’un décalage électrophorétique du produit de PCR, par rapport à celle de l’ADN des tissus normaux, a été détecté dans au moins deux des loci. Immunohistochimique expression de p53 protéine

la protéine p53 a été détectée en utilisant immunohistochimique d’un anticorps monoclonal p53 de souris (clone 1801, BioGenex, San Ramon, CA, USA) à une dilution de 1: 150 avec une incubation de 50 min à température ambiante sur un TechMate 500 Stainer automatisé (Ventana, Tucson , AZ, USA) stade grande petite espérance de vie du cancer du poumon à petites cellules. La coloration p53 a été marqué en fonction de l’intensité de la coloration nucléaire et le nombre de cellules colorées selon un système de notation subjective. L’intensité de la coloration a été divisé en quatre catégories 0 = 1 = négatif, faiblement positif:, 2 = modéré 3 = positif et fortement positif. La quantité de cellules colorées a été notée comme suit: 0 = pas de coloration, 1 = 1-10%, 2 = 11-50%, 3 = 51-80% et 4 = gt; noyaux de tumeur de 81% colorées. Un score immunoréactive a été rendu en tant que produit des scores obtenus pour l’intensité de la coloration et de la quantité. Un score total de 0 a été considéré comme négatif, 1-3: faible, 4-7: modérée et 8-12: forte immunoréactivité.

Le comportement biologique de UCC a suscité une controverse dans la littérature. 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 Il est généralement considéré comme un type de tumeur agressive semblable à un carcinome séreux de l’endomètre carcinome spinocellulaire poumon icd 10. Cependant, des études récentes ont suggéré qu’il a une meilleure survie que l’USC. 16, 21 Le modèle de carcinogenèse duale de l’endomètre, initialement proposée sur la base des différences entre les sous-types clinico-pathologiques endometrioid et séreux de l’adénocarcinome de l’endomètre, 1 a reçu un large appui des études immunohistochimiques et moléculaires. 2, 3, 9 carcinome à cellules claires, bien que classé avec adénocarcinomes séreuse en raison de leurs similitudes clinicopathologic, n’a pas été étudiée en utilisant des techniques moléculaires. Pour tenter de comprendre les fondements moléculaires et d’affiner notre compréhension de ce sous-type de tumeur, nous avons entrepris une étude moléculaire UCC et évalué 11 cas de pur et cinq cas de carcinome à cellules claires mixte de l’endomètre pour les mutations dans p53 et les gènes PTEN et MI.

PTEN est un gène suppresseur de tumeur située dans la région chromosomique 10q23, d’abord identifié sur la base de LOH sur le chromosome 10q23 dans une variété de tumeurs humaines. 24 Cette découverte, ainsi que l’observation selon laquelle le chromosome de type sauvage 10 supprime la tumorigénicité de cellules de glioblastome chez la souris a suggéré la présence d’un gène suppresseur de tumeur à ce locus, a ensuite identifié et clone comme le gène PTEN. PTEN mutations ou suppressions homozygotes ont été identifiées dans plusieurs types de tumeurs, y compris la prostate, du sein et le cancer de la thyroïde. 24 Tashiro et al 5 évalué la présence de mutations de PTEN dans les cancers de l’endomètre et trouvé présent exclusivement dans le sous-type de endometrioid. carcinomes à cellules claires ne sont pas évaluées dans leur étude. Levine et al 25 ont démontré des mutations de PTEN dans hyperplasie atypique complexe et a conclu que les mutations du gène PTEN peut être un événement précoce dans la pathogenèse de l’adénocarcinome endométrioïde. Il est rare de trouver des mutations de PTEN dans le carcinome séreux 2 et dans une étude récente 5 les six tumeurs séreuses manquait des mutations détectables dans ce gène. Si le carcinome à cellules claires est similaire dans sa pathogenèse du carcinome séreux, qui est, de type II, les mutations PTEN seraient censés être faibles en fréquence dans ce sous-type le carcinome à cellules d’avoine du poumon. En effet, près de 80% de l’UCC n’a pas montré une mutation dans le gène PTEN dans notre étude. Dans les trois cas, avec une mutation de PTEN, les patients étaient âgés et l’endomètre adjacentes ne montrent des signes d’hyperplasie, les résultats cliniques et pathologiques plus souvent associés à une tumeur de type II. Deux tumeurs plus montré MI. La taille de l’échantillon des tumeurs avec mutation PTEN est trop faible pour tirer des conclusions importantes mais qui ne soulèvent la possibilité qu’un sous-ensemble d’actions UCC de voies moléculaires du type typique I carcinome de l’endomètre. Il est intéressant de noter que la fonction de suppresseur de tumeur de la protéine PTEN est supposée être dérivé de phosphatase domaine catalytique qui est codée sur l’exon 5 du gène et des anomalies dans cette région peut être important pour la perte de la fonction du gène PTEN. Dans l’étude de Yaginuma et al, 26 mutations dans l’exon 5 ont été observées dans 36% des carcinomes de l’endomètre étudiés avec un seul cas d’une anomalie de l’exon 7; Cependant, le type histologique n’a pas été spécifié dans leur étude. Les deux cas purs UCC dans notre étude a montré une mutation impliquant exon 8 du gène PTEN et dans le seul cas de UCC mixte / UEC, la mutation en cause exon 7 carcinome rénal sites de métastases. Dans cette étude, nous avons choisi de limiter notre analyse aux cinq exons du gène PTEN (exons 3,4,5,7 et 8) avec la plus haute fréquence des mutations. De plus, nous n’avons pas essayé d’identifier les suppressions homozygotes et / ou hétérozygote du gène PTEN.

Les microsatellites sont des segments hautement répétitives d’ADN constituées de 2-5 nucléotides situés principalement dans les régions non codantes du génome. MI a d’abord été décrit dans le cancer du côlon héréditaire sans polypose, 27 où la présence de mutations dans les gènes de réparation des mésappariements de l’ADN, l’ADN de la tumeur présente de nouveaux allèles microsatellites. Des études antérieures ont démontré la positivité MI dans 17-25% des UEC. 6, 7, 8 Il est rare de trouver MI à USC. 28 Risinger et al 29 ont analysé sept type II (cellule séreux ou claire) pour MI et ont été incapables de démontrer le phénotype MI dans l’une quelconque des tumeurs. En revanche, MI a été identifié dans six adénocarcinomes de l’endomètre endométrioïdes dans la même étude. De même, les 34 adénocarcinomes de l’endomètre séreux évaluée par MI Tashiro et al 28 ont été trouvés être négatifs. L’étude actuelle montre la positivité MI dans deux cas (14%) de UCC analysés. Un cas a été UCC pur et l’autre mixte UCC / UEC. En outre, les deux tumeurs avec MI ont montré des mutations PTEN: un faux-sens et une mutation non-sens. Il n’y a pas de précurseur connu de UCC morphologique et donc la relation de mutation PTEN à MI dans le cas unique de pur UCC est peu claire.

Des études récentes ont montré une incidence significativement plus élevée de la mutation du gène p53 dans l’USC par rapport à UEC. 3, 9, 10 La présence d’une mutation est généralement associé à une expression forte et immunohistochimique diffuse du carcinome épidermoïde protéine p53 histologie des poumons. Nous avons trouvé une forte expression de la protéine p53 dans 30% des tumeurs, la majorité étant de type mixte. Nos résultats sont en accord avec ceux de Lax et al, 11 qui a trouvé une forte expression de la protéine p53 dans seulement 25% de UCC. Des mutations du gène p53 ont été confirmés dans quatre des cinq cas avec une forte expression immunohistochimique de la protéine p53 dans cette étude. Il est intéressant de p53 mutations ont été identifiées dans une seule (9%) de l’UCC pur. Cette conclusion, bien que limitée par la petite taille de l’échantillon, suggère que les voies moléculaires pour UCC n’impliquent probablement pas des mutations du gène p53 avec la même fréquence observée dans l’USC (supérieure à 90%). Plus de cas de UCC pur doivent être évalués pour déterminer la véritable fréquence des mutations de p53 dans ces tumeurs. La présence de mutations identiques dans les composants de UCC UCC et non des tumeurs mixtes supporte une origine monoclonale des deux composants et suggère que la divergence morphologique a eu lieu après la transformation néoplasique. Nous avons étudié la possibilité de contamination croisée au cours de la procédure de microdissection comme une raison possible pour la présence de mutations identiques dans la cellule claire et les composants de cellules non claires des tumeurs mixtes. Dans le cas 6, bien que des mutations identiques dans le gène p53 ont été identifiées (Tableau 3) dans les deux composants, les différents modes de LOH ont été observées (tableau 2) Code CIM 10 pour le carcinome des cellules rénales. La composante UCC a montré LOH au locus D18S58, tandis que la composante séreuse avait LOH au locus D2S147. Cela démontre clairement l’intégrité de la technique de microdissection dans notre étude. En outre, il apporte un soutien supplémentaire pour l’origine monoclonale des deux composants et suggère que la divergence morphologique ultérieure est associée à des changements génétiques sous-jacents.

Dans les neuf cas de UCC pur, seulement trois cas (33%) ont montré des mutations dans les gènes testés ou toute preuve de MI. Ces résultats suggèrent que dans le phénotype pur, il existe une hétérogénéité génétique. L’échantillonnage est toujours un problème et peut expliquer une partie de la variabilité génétique observée dans nos cas. Cependant, la différence de la prévalence des mutations dans le pur et le type mixte est remarquable (33 vs 80%), bien que les chiffres ne sont pas assez grand pour permettre une analyse statistique. Un examen des caractéristiques histologiques et cliniques des trois cas purs qui ont montré des mutations n’a pas révélé de différence significative de ces tumeurs pures qui ne disposaient pas des mutations détectables (tableau 4). Il serait intéressant de voir des études similaires avec analyse moléculaire et un suivi clinique pour déterminer si la présence de ces mutations a une signification pronostique.

En conclusion, nous avons étudié 16 cas de UCC de l’endomètre pour les mutations dans le gène PTEN, gène p53 et la présence de MI directives de traitement du carcinome à cellules rénales. Nos résultats démontrent que la majorité des UCC pur ne montrent pas des mutations dans les deux gènes étudiés dans le présent rapport. Dans les tumeurs avec un aspect histologique mixte, nos données confirment une origine monoclonale pour la cellule claire et les composants de cellules non claires. Cette étude, bien que petite, soulève des questions importantes concernant la pathogenèse de UCC et la nécessité de séparer pur de carcinomes à cellules claires mélangées dans les futures études clinico. De plus en plus d’études sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent cette tumeur sont révélés, nous pouvons être en mesure de mieux comprendre la pathogenèse de cette tumeur. L’absence de mutations dans le gène PTEN et le gène p53 dans la majorité des UCC devrait pur inciter à rechercher d’autres modifications génétiques dans cette variante de carcinome de l’endomètre, afin d’approfondir notre compréhension de la pathogenèse et le comportement biologique.